【文献分享】Pathway in Plants for Enzyme Replacement Therapy of Lysosomal Storage Disorders

目前批准的基于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的重组 IDUA（商品名：艾而赞）是目前唯一能够治疗MPSⅠ型患者的生物制剂，但价格昂贵，海外患者使用该药物年费高达20万美元，参照国际药价，药品在华上市后，如果不能进入医保，要使用该款药物，一年的药费要将近260万，并且需要终身用药。

为了生产一种更具成本效益和安全的替代商业哺乳动物细胞生产系统的方法，该团队建立了一个高效的植物重组蛋白生产平台，可在复合聚糖种子中高水平合成有活性的人IDUA。然而，ERT 中肠胃外施用的重组酶必须具有合适的靶向信号，用于胞吞至患者细胞中以及细胞内递送至溶酶体，以便具有治疗效果。对于大多数溶酶体酶（包括 IDUA），这通常需要将细胞识别标记 6-磷酸甘露糖 (M6P) 添加到替代蛋白上。然而，植物不具备将 M6P糖基化添加到目标蛋白的酶机制。Journal of Clinical Medicine杂志2019年12月发表了题为“Toward Engineering the Mannose 6-Phosphate Elaboration Pathway in Plants for Enzyme Replacement Therapy of Lysosomal Storage Disorders”的文章，该文章的主要策略是在拟南芥种子中表达整个人类M6P酶机制，以实现IDUA的植物体内甘露糖磷酸化。

哺乳动物细胞进行甘露糖磷酸化需要两种高尔基体定位酶：GlcNAc-1-磷酸转移酶 (PT)，将 UDP-GlcNAc 添加到目标酶的高甘露糖 N-聚糖的选定末端甘露糖残基上，以及 N -乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸二酯 α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，也称为“发现酶”(UCE)，可裂解 GlcNAc 残基以暴露 M6P 标签。作者首先在cgl拟南芥种子中成功表达了UCE酶，western blot结果显示UCE的前肽能够被植物正确翻译并切割，进一步检测表明纯化的可溶性 UCE 酶具有高活性，并且在 IDUA 的连续体外磷酸化中发挥作用。

随后，作者在高产IDUA的拟南芥cgl种子中分别表达了PT-γ、PT-αβ和UCE。在PT-αβ两个亚基的序列之间设计了三个不同的切割位点，对代表性转基因品系的总蛋白种子提取物的蛋白质印迹分析所示，所有三种切割选项都能够成功产生αβ-前体亚基。

最后，作者在植物中将 M6P 加工所需要的所有三个酶基因同时表达，在idua 缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞上进行了M6P-IDUA的摄取研究。小鼠胚胎成纤维细胞内部 IDUA 活性的吸收程度与具有高甘露糖 N-聚糖的cgl-IDUA相似，但略低于商业对应物 Aldurazyme ®, 约为Aldurazyme ®的70% 。Idua 缺乏会导致未降解的 GAG 在细胞内积聚。植物 M6P-IDUA导致GAG大幅减少约44%，而 Aldurazyme ®则减少了约 56%。表明用M6P标签修饰IDUA的效率较差。这可能是由于植物中PT 的不稳定性，因为 PT 转录本存在于多个品系中，但对应的蛋白质仅以少量存在。

综上所述，用植物完全在体内产生M6P糖基化具有诸多难点：1. 纯化的 IDUA 是由高甘露糖末端 IDUA 和来自转基因种子的假定 M6P-IDUA 的混合物组成，因此 M6P-IDUA 蛋白的比例很可能相对较小而无法让酶的治疗特性产生差异；2. PT-αβ亚基可能没有正确定位到植物细胞的顺式高尔基体，导致PT-α/β或PT异六聚体的不稳定，丧失其生物学功能。PT-α、-β和-γ亚基也可能无法在植物细胞中组装成αβγ全酶。由于M6P精加工过程本身很复杂，合成、加工和瞄定部位所需的步骤也很复杂，因此该过程相对低效可能还有其他的根本原因。

除此之外，尽管M6P受体是这些细胞中主要的质膜受体类型，但甘露糖末端的植物 IDUA 仍显示出显着的摄取量，还可以有效减少 GAG 底物。说明M6P 靶向可能并不是细胞吸收溶酶体酶的唯一方法。